Olivos al microscopio II:
Reproducción.

 

      (*)

NOTA IMPORTANTE

INTRODUCCIÓN.-

     Como hemos mencionado en la página principal del proyecto, pretendemos tener imágenes microscopicas de todos los órganos del olivo, procedentes de tres fuentes diferentes: Preparaciones "caseras", "profesionales" y obtenidas de publicaciones. Lo más probable, es que en esta ocasión nos limitemos a las preparaciones "caseras", a las imágenes publicadas y algunos modelos tridimensionales basado en las imágenes obtenidas; aunque no descartamos la posibilidad de añadir imágenes de las que denominamos "profesionales" si a lo largo del proyecto conseguimos la colaboración necesaria.

     En "Olivos al microscopio II: Reproducción" nos centraremos en el estudio de los órganos reproductores del olivo y en la aceituna como resultado de los procesos encaminados a la reproducción.

     Aunque es posible que a medida que desarrollemos el proyecto surjan otras actividades, inicialmente pensamos realizar preparaciones y algún modelo de los órganos implicados en la reproducción o el resultado de ésta.
     Nuestro objetivo principal es que los visitantes se hagan conscientes de las características histológicas de las partes del olivo estudiadas y de su relación con aspectos agrícolas e industriales.

     Las flores del olivo son pequeñas y poco vistosas, en algunas ocasiones nos hemos ocupado de sus aspectos macroscópicos pero hemos realizado pocas observaciones miscroscópicas de las flores y prácticamente ninguna de la aceituna. Como el pasado año dividiremos el proyecto en tres apartados: Preparaciones, modelos e imágenes publicadas.

Preparaciones:
     Para conseguir nuestro objetivo de poner a disposición del profesorado técnicas de fácil realización, tenemos previsto experimentar con algunas descritas en la bibliografía especializada y otras de desarrollo personal. En relación con estas últimas vamos a comenzar con un sistema empleado en geología pero del que no tenemos ninguna referencia de su aplicación en materiales biológicos. La denominaremos "Técnica de inclusión en resina y pulido".

     Debido a que el olivo no florecerá hasta poco tiempo antes de la celebración de la Feria, iremos poniendo a punto todas las técnicas con materiales congelados del año pasado. Nuestra intención es repetir la mayoría de las preparaciones con material fresco para sustituir las imágenes por otras de mayor calidad, aunque no tenemos seguridad de poder completarlo antes de la Feria.

Técnica de inclusión en resina y pulido

     Para la realización de preparaciones de rocas, normalmente se siguen los siguientes pasos:

  1. Cortar una sección de la roca de aproximadamente 1 mm de espesor.
  2. Pulir una de las caras de dicha sección.
  3. Pegar la sección a un portaobjetos por la cara pulida
  4. Reducir la sección mediante lijado hasta reducirla a unas 50 micras de espesor.
  5. Pulir la cara para eliminar todas las marcas del lijado.

     En nuestro caso procederemos de la forma siguiente:

  1. Corte de las muestras a pequeño tamaño y fijado de las mismas.
  2. Deshidratación de la muestra.
  3. Inclusión en resina de poliéster.
  4. Corte de una sección de la muestra de aproximadamente 1 mm de espesor.
  5. Pulido de una de las caras de dicha sección.
  6. Pegado de la sección a un portaobjetos por la cara pulida
  7. Redución de la sección mediante lijado hasta reducirla al espesor adecuado.
  8. Pulido de la cara para eliminar todas las marcas del lijado.
  9. Pintado con laca de uñas incolora para corregir imperfecciones y arañazos.

      Al tratarse de una técnica de la que no existen referencias hemos creído conveniente realizar una experiencia previa consistente en probar con una muestra de material biológico previamente incluida en resina según técnicas de amplia utilización en microscopía electrónica. El material biológico, del que dispongo inclusiones en resina, es el correspondiente a mi tesis doctoral, realizada sobre piel de anfibios y reptiles. En la tabla siguiente presentaremos algunas imágenes junto con las descripciones correspondientes.

     Éste era el aspecto inicial de los bloques empleados para la prueba. Se trata de fragmentos de piel dorsal de un sapo (Epidalea calamita (=Bufo calamita)) fijados con glutaraldehido y tetróxido de osmio. El color oscuro de las muestras se debe al efecto de tinción del tetróxido de osmio. A partir de este bloque se cortaron dos pequeños fragmentos, que contenían la muestra, con la ayuda de una tenaza de bordes afilados.

     Estos fragmentos se alisaron y pulieron (1) por una de sus caras y posteriormente se pegaron a un porta. En el caso de la muestra superior se utilizó pegamento instantáneo y posteriormente se englobó en una gota de pegameno de dos componentes (resina epoxi). La muestra inferior se fijo únicamente con dicha resina. No se observó ninguna diferencia entre ellas debida a la fijación.

(1) Se utilizó lija de agua del número 320 para el alisado, y de 400 y finalmente de 1200 para el pulido. El pulido final se realizó empleando aceite en lugar de agua.

     Aspecto de las dos muestras en las fases iniciales. En la de la derecha todavía se aprecian las estrías de la fase de alisado.
     Con iluminación por reflexión se observa el brillo producido por la capa de melanóforos e iridóforos, que se disponen bajo la epidermis.

     A medida que avanza el proceso empiezan a distinguirse diferentes estructuras. En estas imágenes se aprecian desde arriba hacia abajo las siguientes:

  1. Epidermis.
  2. Dermis
    1. Iridóforos (capa clara). Entre éstos y la epidermis exie otra capa (xantóforos) que no se aprecia en las imágenes.
    2. Melanóforos (células oscuras)
    3. Glándulas y vasos sanguíneos presentes en la dermis.
    4. Fibras
     En estas imágenes pueden observarse las ramificaciones dendríticas que poseen los melanóforos
     Aspecto final de la muestra y detalle de la epidermis.
     Las imágenes de la tabla que figura debajo proceden de mi tesis, habiéndose obtenido de preparaciones correspondientes a secciones de diferentes grosores realizadas con un ultratomo LKB III. Las imágenes se tomaron con un microscopio modelo "Universal Zeiss".
  

Corte de 3 micras sin teñir observadas con contraste de fases

Fotografía en blanco y negro de un corte de 0.5 micras teñidas con azul de toluidina.

Corte de 3 micras sin teñir observadas con campo oscuro.

     La imagen siguiente corresponde a un pétalo tratado con esta técnica.

     En la página "Materiales y métodos"   puede ampliarse la información y los resultados obtenidos con esta técnica.

Otras técnicas más simples.

     Plastificado directo de las muestras utilizando bolsas de plastificado instantáneo.

     Adherido sobre cinta adhesiva y pegado sobre el porta, con el material todavía congelado.
  Adherido sobre cinta adhesiva y pegado sobre el porta, con el material descongelado y a temperatura ambiente.
  Inmersión de la aceituna en agua hirviendo y retirada de la piel.
   Impregnación y pegado directo con pegamento instantáneo.
 

Materiales y métodos.

Modelos.
     Los modelos tridimensionales son más fáciles de interpretar que las preparaciones, ya que nos permiten apreciar la disposición espacial de las estructuras. Todavía no hemos decidido los modelos que realizaremos, pero probablemente serán dos:

Estos modelos se realizarán a escala empleando básicamente porexpán de alta densidad,

Imágenes de Internet.
     Además de las preparaciones y modelos de realización propia, procederemos a un rastreo de imágenes publicadas, ya sea en revistas especializadas o en Internet.

     Dispondremos de microscopios y preparaciones para que los visitantes puedan observar las estructuras, y materiales para que los que lo deseen puedan realizar las preparaciones.

     En esta página describiremos las técnicas de preparación y algunas imágenes, si bien la mayor parte de éstas las dispondremos en otra página a la que podrá accederse mediante el enlace situado bajo la tabla siguiente.
     La mayoría de las imágenes se han realizado con el microscopio Biolux y la cámara incorporada que describíamos en la página anterior. En las imágenes tomadas con otros medios se indicará con un número entre paréntesis correspondiente al medio utilizado. La primera imagen realizada con un instrumento incluirá un enlace para enlazar con la imagen del mismo de la página anterior.

Acceso al proyecto.

Actividades

Preparaciones
Granos de polen
     La observación de granos de polen es bastante fácil, ya que pueden observarse directamente sobre el porta o fijarlos mediante cualquier técnica simple. En este caso se utilizaron láminas de plastificado instantáneo.
     Los granos de polen del olivo son de forma ovoide, casi esferoidales, y con relieves muy marcados en su superficie. Posee tres hendiduras longitudinales que facilitan su apertura.
 
Estructuras florales.
     Zona de inserción de los órganos reproductores en el centro de los pétalos.
     Los pétalos y el estilo se encuentran recubiertos de tricomas, similares a los descritos en el proyecto del pasado curso, como puede observarse en estas dos imágenes.
     El estilo posee unos resaltes a modo de nervaduras longitudinales.
Estructuras presentes en la aceituna.

     En la aceituna podemos distinguir el pericarpio y la semilla. A su vez el pericarpio está dividido en tres partes:

  • Epicarpio o piel.
  • Mesocarpio, zona carnosa.
  • Endocarpio o hueso, en el que una vez abierto podremos ver la semilla.

     En esta imagen podemos ver el aspecto del epicarpio visto desde el exterior de la aceituna.

     El mesocarpio

    Se dispone debajo del epicarpio y representa la mayor parte del volumen de la aceituna.

    Sus células son redondeadas y poseen en la madurez una gran gota de aceite, y otras mucho más pequeñas presentes en sus cloroplastos.

     El endocarpio

    El hueso ocupa la zona central de la aceituna y su tamaño es variable dependiendo de la variedad.
    En su pared encontraremos esclereidas, haces vasculares y otras estructuras que le dan su consistencia.

     La semilla posee un epitelio que recibe el nombre de tegumento y en su interior encontramos el embrión y un tejido nutricio, el endospermo.

     El endospermo

     Es un tejido triploide, ya que se forma por la unión de los dos núcleos polares del saco embrionario y uno de los núcleos del grano de polen.

     El embrión.

 

Modelos
Detalles de la flor del olivo.

     La flor del olivo es blanca y de pequeño tamaño. Su cáliz formado por cuatro sépalos soldados adquiere la forma de un cilindro con cuatro pequeñas expansiones que le dan un aspecto ligeramente festoneado. Su corola está formada por cuatro pétalos en cruz que en su base se sueldan en un tubo de escasa longitud. Posee dos grandes estambres de filamento corto, y un pistilo central cuyo estigma presenta dos lobulos.

     Estas flores nos serviran de base para la construcción del modelo.

 

NOTA.- Aunque las flores se suelen ajustar a la descripción anterior no es demasiado raro encontrarnos con flores pentámeras.

     Comenzamos creando la corola recortando los cuatro pétalos a partir de una lámina de espuma para embalaje.
     Los pétalos poseen un nervio central y algunos laterales que discurren más o menos paralelamente al borde. Para la realización de estas nerviaciones hemos pegado alambres en el envés mediante pegamento de tipo "no más clavos".      Estos alambres nos permitirán modificar la forma del pétalo y construir con la base de los mismos el tubo del que estos nacen.
     Este tubo lo hemos pegado sobre un cilindro de porexpan de alta densidad que nos servirá de base para todos los elementos de la flor.
     Su cáliz, formado por cuatro sépalos soldados, adquiere la forma de un cilindro con cuatro pequeñas expansiones que le dan un aspecto ligeramente festoneado.
     En esta imagen podemos observar los materiales que utilizaremos para fabricar el cáliz. Es necesario emplear una banda elástica de refuerzo para que al tirar de la lámina de espuma no se rasgue por las escotaduras.
     Hemos pegado la zona picada en la base del cilindro que nos sirve de soporte para que los extremos de los "sépalos" queden adosados a los "pétalos". Posteriormente se han disimulado las uniones con masilla acrílica.
     Se han exagerado los extremos de los sépalos para resaltar el carácter tetramero de esta flor.
     Finalmente se ha lijado, y pintado con pintura acrílica. En la base del caliz se ha fijado un pequeño pedúnculo de porexpan mediante un tornillo que lo atraviesa.
     Posee dos grandes estambres de filamento corto, y un pistilo central cuyo estigma presenta dos lobulos.
     Los filamentos se han fabricado con un trozo de espuma de embalaje redondeadño en cuyo interior se ha introducido un alambre para facilitar su forma y permitir que sostenga el peso de las anteras. Éstas se han realizado con dos láminas finas de espuma de embalaje.
     Tras unir las dos partes formando un saco.
     Posteriormente se han pintado con pintura de caucho de color rosado y espolvoreado con cúrcuma con la pintura todavía fresca. Posteriormente se han rellenado con semillas de mijo, pequeñas y de forma esférica, teñidas con pintura acrílica amarillo-naranja, que simularán granos de polen.      Para que estas semillas permanecieran en las anteras se pulverizaron con cola de carpintero diluida. Este mismo procedimiento se utilizó para la fijación de "granos de polen" en el exterior.
     El pistilo presenta al principio un estilo largo y delgado que termina en un estigma bífido con abundantes papilas (detalle tomado de la imagen de entrada al proyecto).
     El pistilo se ha hecho con porexpan de alta densidad, y láminas de espuma de embalaje y alambre para los lóbulos del estigma (recuadro). Finalmente se han pintado con pintura acrílica . Se ha representado en una fase más avanzada en la que el óvulo ya debe haber sido fecundado (lóbulos más marcados que en la realidad).
     
El hueco central del estilo se ha revestido con algunos filamentos de "musgo" para belenes teñidos con cola diluida y colorante alimentario para simular las papilas.

Para realizar las papilas se procedió de la forma siguiente:

  1. Colocar las fibras paralelas sobre una cinta de Celo.
  2. Añadir una gota de cola de carpintero.
  3. Colocar un trozo de macarrón de riego sobre la gota.
  4. Cerrar la cinta de Celo en torno al macarrón.
Modelo acabado.
Histología de la aceituna.
Pericarpio
    Para que los visitantes puedan situarse facilmente contaremos con este modelo de una aceituna eleborado por nuestr@s alumn@s para el proyecto presentado en la 5ª Feria de la Ciencia.

     A partir del modelo anterior vamos a elaborar nuestro modelo a escala microscópica.

     Lo realizaremos con una plancha de 6 cm de grosor de porexpán de alta densidad. El tamaño completo del modelo tendrá aproximadamente medio metro, treinta centímetros para el pericarpio y veinte para la semilla.

     Lo realizaremos con una plancha de 6 cm de grosor de porexpán de alta densidad. El tamaño completo del modelo tendrá aproximadamente medio metro, treinta centímetros para el pericarpio y veinte para la semilla.Comenzaremos recortando las piezas con un cuchillo de cocina y modelándola a continuación con bloques de lija.

     El siguiente paso es dibujar en cada bloque los contornos de las células que lo forman. Evidentemente las proporciones del bloque y las células no son las adecuadas, ya que hemos querido resaltar estructuras celulares y al mismo tiempo situar cada capa en la aceituna. El tamaño de ésta es unas 5 veces mayor que el de la modelo completo mostrado anteriormente.

     El pericarpio, que es la parte del fruto que envuelve a la semilla consta de tres partes:

  • Epicarpio o piel.
  • Mesocarpio o pulpa.
  • Endocarpio o hueso.

 

    Intentaremos reproducir la forma y características de las células de cada zona. Nos basaremos en las imágenes de los recuadros, que pueden verse, así como sus procedencia en la página de micrografías.

    Evidentemente no podemos representarlo a escala, ya que para que las células del mesocarpio tuviesen ese tamaño una tapa de aceitunas no cabrían en un campo de fútbol.

Epicarpio.

    Está formado por células aplanadas de forma poligonal, y en nuestro modelo ocupa algo más de un centímetro en la zona superior, correspondiente al exterior de la aceituna. Sobre esta capa celular de dispone una cutícula que fabricaremos con barniz al alcohol del utilizado para manualidades.
Mesocarpio.

    Dispuesto bajo el anterior representa aproximadamente el 60% de la sección de una aceituna y algo menos en nuestro modelo (aproximadamente 20 cm). Lo hemos representado con 5 o 6 capas de células para mostrar su morfología. Estas células son redondeadas y poseen en la madurez una gran gota de aceite. En sus cloroplastos, situados en la periferia, podemos encontrar gotas de aceite de tamaño mucho menor

Endocarpio.

    El hueso ocupa en la realidad el 40% restante, pero en nuestro modelo se ha exagerado para poder representar las características de su pared (algo más de 10cm en el modelo) y la semilla que se aloja en el interior.
    En esta pared encontraremos esclereidas, haces vasculares y otras estructuras que le dan su consistencia.     Podremos ver numerosos haces de esclereidas alargadas y otras de forma más redondeada y aunque es difícil precisar los límites aparecen algunas variaciones en sus márgenes exterior e interior.

    El paso siguiente es marcar todos los límites celulares con un soldador para que queden bien definidos cuando pintemos el modelo.
    Ahora deberemos pintar las llagas que marcan los límites celulares. Utilizaremos pintura marrón oscura para el endocarpo y verde para el resto de las capas.
    Cuando la pintura de las llagas que marcan los límites celulares esté seca pintaremos con colores, similares a los anteriores pero más claros, el interior de todas las estructuras. Escurriremos muy bien el pincel para que la pintura no caiga en el interior de las ranuras.
    El paso siguiente será dibujar en el interior de las células los componentes más importantes: gotas de aceite (que en la madurez ocuparán casi toda la célula), núcleos y algunos cloroplastos.
    En esta imagen pueden verse los detalles del interior de las células del mesocarpo destacando las grandes gotas de aceite, algunos núcleos y varios cloroplastos. En el interior de estos últimos se han señalado algunas gotitas minúsculas de aceite.

    Finalmente crearemos una cutícula sobre la superficie del epicarpio.

    Para crearla hemos utilizado barniz al alcohol para manualidades, ya que el barniz clásico disolvería el porexpan. También podría haberse utilizado barniz acrílico.
    Para evitar que el barniz descuelgue hemos dispuesto un cordón de plastilina como puede verse en el recuadro.

Semilla
     El contacto entre el endospermo y el embrión se ha representado con trazo irregular, ya que, a diferencia de las demás partes, no se corresponde con una disposición concéntrica.

     En el modelo dejaremos un espacio, en el color original del porexpan, para indicar su separación respecto al endospermo, y representaremos dos embriones para indicar la existencia en algunos casos de dos semillas en el interior del hueso. Debe quedar claro que es una forma de representación y que puede haber dos semillas en el interior del hueso, pero nunca dos embriones en el interior de una semilla.
En la semilla podemos distinguir tres partes:

  • Tegumento
  • Tejido nutricio o endospermo
  • Embrión.

Tegumento.

     Capa externa de la semilla con función protectora, en ella se distinguen una zona exterior o testa y otra interior o tegmen

     En nuestro modelo no representaremos estas diferencias.

Tejido nutricio o endospermo.

     Al igual que en la representación del mesocarpio, alteraremos la escala para poder representar las características de las células. Éstas están repletas de pequeñas gotitas de aceite y algunos acumulos proteicos de mayor tamaño, en algunos casos podremos observar sus núcleos.

Embrión.

     Como ya hemos mencionado, hemos representado dos embriones para que desde cualquier punto de vista puedan observarse las zonas desde las que se dará lugar a cada parte de la futura planta:

  • Plúmula (tallo)
  • Radícula (raíz)
  • Cotiledones (hojas)

    Como hemos hecho en el pericarpio marcaremos los límites celulares con un soldador para que queden bien definidos y pintaremos las llagas que los marcan. Utilizaremos pintura marrón oscura para el tegumento y el endospermo y azul para el embrión.

    Cuando la pintura de las llagas esté seca pintaremos con colores, similares a los anteriores pero más claros, el interior de todas las estructuras. Escurriremos muy bien el pincel para que la pintura no caiga en el interior de las ranuras.
    En el endospermo dibujaremos en el interior de las células los componentes más importantes: pequeñas gotas de aceite (que en la madurez ocuparán casi toda la célula), núcleos y depósitos protéicos.
    En esta imagen pueden verse los detalles del interior de las células del mesocarpo destacando las grandes gotas de aceite, algunos núcleos y varios cloroplastos. En el interior de estos últimos se han señalado algunas gotitas minúsculas de aceite.
Modelo terminado.
    Este es el aspecto final del modelo, en el que aparecen rotulados todos sus elementos.

Imágenes directas (Macro o microscopio)

Obtenidas con el microscopio digital correspondiente al nº (7)


Otras imágenes macro

 

Acceso a las micrografías.

 

Webs de interés.

Procedencia de las imágenes:

Profesores implicados:

Juan Jiménez Pérez
(Antiguo miembro del Grupo de Trabajo de Ciencias Naturales de Arahal-Paradas, creador de los materiales originales)

y

Carlos Zamorano Leal
(Antiguo coordinador del Proyecto Olivar y Escuela y actual Webmaster de esta página).

 

(*)

Fotografía de M.C. Fernández, obtenida del libro "El cultivo del olivo"

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NOTA IMPORTANTE:

      Como ya publiqué en la página de novedades, debido a problemas de salud tuvimos que interrumpir la preparación de actividades y finalmente suspender nuestra participación en la 17ª edición de la Feria de la Ciencia. Una vez superado el periodo de reposo asociado a la intervención retomamos el proyecto, que esperamos esté acabado para la próxima edición.
      Comenzaremos en el punto en que se interrumpió el proyecto, continuando con la elaboración de modelos.
      Dejaremos el proyecto previsto para esta edición sin modificar e incorporaremos las actividades y materiales de nueva creación al proyecto correspondiente a la 18ª edición de la Feria de la Ciencia prevista para mayo de 2020